Parâmetros e calibração

Valores de config/primers.toml, versionados com o código e somente leitura nesta versão. Os marcados conferir vêm do guia de desenho da Eiken (PrimerExplorer) e ainda não foram conferidos no documento original.

Tm de conjunto_ok × alvo_ok contra as faixas do guia

Opção A adotada faixas a calibrar

Faixa do guia Tm de referência (PrimerExplorer V5) Tm da reação (informativa) primers do lado B

Externos faixa 59–61 °C · 200 nM na reação a calibrar

F3 B3

Internos, ponta 3′ faixa 59–61 °C · 1600 nM na reação a calibrar

F2 B2

Internos, ponta 5′ faixa 64–66 °C · 1600 nM na reação a calibrar

F1c B1c

48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 °C

Nenhum dos 6 primers medidos fica dentro da faixa. Na reação, a Tm dos primers em duplex fica em média 5,6 °C acima da Tm de referência. F1c e B1c entram na reação como dobramento, fora da média.

Opção A adotada: as faixas da Eiken valem na convenção do PrimerExplorer V5 (oligo 100 nM · Na⁺ 50 mM · Mg²⁺ 4 mM), que o projeto reproduz; a Tm da reação é só informativa.

Antes de mudar qualquer faixa: os testes do primers usam valores calculados com este config. Congelar um config só para os testes evita que a calibração quebre testes que não têm erro.

Condições de reação

Monovalentes: 70 mM; Na⁺ 0 + K⁺ 50 + NH₄⁺ 20 mM. Conferir: a mistura WarmStart é proprietária; o tampão isotérmico 1X da NEB tem 50 mM de KCl e 10 mM de (NH₄)₂SO₄.
Mg²⁺: 8 mM; Livre: 2,4 mM, o total menos o dNTP total.
dNTP: 1,4 mM cada; Total de 5,6 mM, o valor enviado ao primer3.
Temperatura da reação: 65 °C; Grampos e dímeros são avaliados nesta temperatura.
Tm de referência: 100 nM · Na⁺ 50 mM · Mg²⁺ 4 mM; Convenção do PrimerExplorer V5, a das faixas da Eiken.
ΔG de ponta: 37 °C · NaCl 1 M; Bases da ponta com iniciação, tabela unificada de SantaLucia (1998), como no PrimerExplorer V5.

Distâncias entre regiões

Distância	Faixa	conjunto_ok × alvo_ok
F2 → B2	120–180	146
F2 → F1	40–60	50
B1c → B2c	40–60	50
F3 → F2	0–60	10
B2c → B3c	0–60	10
F1 → B1c	0–1000	5
F3 → B3	120–280	206

Em nt, na fita em que o conjunto foi localizado. Um conjunto real fora da faixa é argumento para revisar a faixa, não o conjunto.

Regras por primer

Comprimento: 18–25 nt · loops 15–25 nt
GC: 40–65 % conferir
Ponta estável: ΔG°37 das 6 bases ≤ −4 kcal/mol · 3′ de F3, F2, B2, B3, LF, LB; 5′ de F1c e B1c
Concentração: externos 200 nM · internos 1600 nM · loops 400 nM pendente
Dímeros: Só reportados, com a ponta 3′ pareada — limiar a definir com dado
Tm de referência: F3/B3 59–61, F2/B2 59–61, F1c/B1c 64–66 e loops 64–66 °C a calibrar

Desenho

Teto por janela: 2 por tipo a cada 10 nt
Núcleos guardados: até 5.000, do alvo inteiro
Pré-seleção: 50 conjuntos para a etapa de dímeros
Peso do dímero: 0,5 por kcal/mol provisório
Resultados: 5
Ligante FIP/BIP: nenhum
Propostas distintas: F2 e B2c não sobrepõem mais de 10 nt ao mesmo tempo